磷酸二酯键的化学式可表示为 R₁-O-P(=O)(O⁻)-O-R₂，其中R₁和R₂代表两个含羟基的有机基团，在核酸分子中特指相邻核苷酸的3'碳和5'碳上的核糖或脱氧核糖残基。这一结构的核心是磷酸基团（P=O）通过两个酯键（-O-）分别连接两个不同的羟基，形成“磷酸-氧-碳”的桥接模式。

在DNA和RNA中，磷酸二酯键的形成具有严格的方向性：前一个核苷酸的3'碳羟基（3'-OH）与后一个核苷酸的5'碳磷酸基团（5'-PO₄³⁻）发生酯化反应，脱去一分子水后形成共价连接。这种3',5'-连接方式使核酸链具有极性——一端为游离的5'磷酸基团，另一端为游离的3'羟基，这一特性决定了核酸复制和转录的方向。

从化学键本质看，磷酸二酯键由一个磷酸基团同时形成两个酯键：P原子通过单键分别连接两个氧原子（-O-），同时与一个氧原子形成双键（P=O），并带有一个负电荷（O⁻）以维持电中性。这种结构赋予核酸链一定的刚性，同时允许局部柔性，是DNA双螺旋结构稳定性与功能活性的基础。断裂该键需要核酸酶催化，这一过程在DNA修复、RNA降解等生命活动中至关重要。